Пошук по сайту


Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну

Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну



УДК 615.361.014.24:535.37
С.Є. Гальченко, Т.С. Дюбко, О.В. Зінченко, Б.П. Сандомирський

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, Харків, 61015, Україна; cryo@online.kharkov.ua;
Є.А. Поврозін

Інститут монокристалів НАН України, просп. Леніна, 60, Харків 61001, Україна; Jimmy_po@ukr.net
Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну
Вивчення взаємодії тканиноспецифічних пептидів, які входять до складу водно-сольових екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів з альбуміном сироватки крові має важливе теоретичне та практичне значення. Це пов’язано з тим, що такі екстракти, будучи введеними в організм, стимулюють репаративні процеси при патологіях відповідних органів [2]. Відомо, що в вільному стані пептиди досить швидко розщеплюються протеазами. У зв’язаному стані, в першу чергу з альбуміном сироватки крові, такі пептиди не підлягають деградації, і тому можуть бути доставлені в потрібне місце в незмінному вигляді. Теоретичне значення роботи полягає в тому, що вивчення процесів термоденатурації надає інформацію, яким чином біологічно активні пептиди екстрактів взаємодіють з цим білком. Різноманітні за своєю природою ліганди впливають на конформацію молекул альбуміну і це спричиняє зміну їх теплофізичних характеристик [13, 14, 16–18]. З практичної точки зору дослідження в цьому напрямку представляють інтерес в плані розробки препаратів імунобіологічної дії на основі екстрактів ксеногенних тканин, оптимізації шляхів їх уведення в організм та контролю ефективності. Таким чином, звязування біологічно активних пептидів з альбуміном є необхідною умовою їх захисту від деградації під дією протеаз, а отже і збереження їх біологічної активності.

Маса альбуміну, який входить до складу плазми крові, становить 47-62 % від усіх її білків [1]. У нього є ряд цінних властивостей, серед яких особливу увагу привертають зв’язування та транспорт низькомолекулярних ендо- та екзогенних лігандів. Коло речовин, здатних зв’язуватись з альбуміном, дуже велике: лікарські засоби, метаболіти, гормони, іони металів, пептиди тощо. Точна кількість лігандів, які здатна зв’язати молекула альбуміна, невідома, інколи вона перевищує 10. Зв’язування однієї молекули ліганда з м.м. близько 300 радикально змінює властивості альбумінової глобули. Така конформаційна рухомість, можливо, пов’язана з участю альбуміну в неспецифічній реакції адаптації [10]. Слід зазначити, що сама молекула альбуміну стабільна, і підлягає протеолізу лише після відповідної модифікації [1, 6].

Попередній аналіз спектрофлуориметричним методом ТЕ, які ми використовували в цій роботі, показав, що до їх складу входять низькомолекулярні речовини пептидної природи, які здатні звязуватись з альбуміном сироватки крові [9]. Встановлений за допомогою цього методу факт впливу ТЕ на спектральні властивості сироваткового альбуміну дозволяє припустити, що при взаємодії альбуміну з ТЕ змінюватимуться і термодинамічні параметри системи „альбумін–ТЕ”, які можуть бути виявлені методом диференциальної скануючої калориметрії (ДСК).

Метою роботи було дослідження за допомогою методу ДСК впливу екстрактів ксеногенних тканин на параметри термоденатурації альбуміну.
Матеріали і методи

В роботі були використані водно-сольові екстракти кріоконсервованих фрагментів печінки (ЕПС), селезінки (ЕСС) і підшлункової залози (ЕПЗС) статевозрілих свиней, які отримували за методом [8]. Для цього органи подрібнювали на фрагменти масою 1-3 мг і заморожували в присутності 10% ПЕО-1500 зі швидкістю 1 0С/хв до -70 0С з наступним зануренням у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані з температурою 40 0С. Від кріопротектора відмивали фізіологічним розчином. Екстракти отримували, інкубуючи деконсервовані фрагменти у фізіологічному розчині в співвідношенні 1:10 при 20-23С протягом 60 хв. Для видалення термолабільних білків екстракти кип'ятили на водяній бані 15 хв і фільтрували.

Розчин сироваткового альбуміну бика (САБ) фірми «Sigma» (США) в концентрації 5 мг/мл готували на 0,05 молярному натрій-фосфатному буфері, рН 7,4. Тканинні екстракти (ТЕ) додавали до розчину в співвідношенні 25 мкл /мл. Експерименти виконували на 3–5 незалежно отриманих препаратах. Вміст пептидів визначали спектрофотометричним методом [7].

Калориметричні вимірювання виконували на диференційному адіабатичному скануючому мікрокалориметрі ДАСМ-4 (СКББП, м. Пущіно, Росія) при нагріві із швидкістю 1 0С/хв і надлишковому тиску 2,5 атм. Термограми САБ і ТЕ реєстрували при наявності в порівняльній чарунці розчинника (натрій-фосфатного буфера), а при реєстрації теплопоглинання сумішей САБ+ТЕ у порівняльній чарунці знаходились розчини ТЕ у відповідних концентраціях. Деконволюцію кривих теплопоглинання виконували за допомогою програмного пакета Peakfit.
Результати власних досліджень

На рис. 1 представлена термограма денатурації САБ та її складові, отримані шляхом деконволюції (розкладення на прості функції). Вигляд профілю термоденатурації нативного САБ добре узгоджується з літературними даними для альбуміну з низьким вмістом жирних кислот [4, 11, 12]. Як видно з рис. 1, профіль термоденатурації САБ досить широкий по температурі і має 3 максимуми теплопоглинання: перший – при температурі 68 оС, другий – 81 оС і третій, найбільш розмитий, близько 97 оС. Це пояснюється тим, що молекула альбуміну має складну мультидоменну структуру, яка, згідно з даними, отриманими раніше методом мікрокалориметрії, складається принаймні з трьох незалежних кооперативних одиниць [4, 5, 11, 12, 15].

У роботі [12] було проведено докладний аналіз кривих плавлення САБ з використанням процедури деконволюції кривої термоденатурації, а також гідролізу молекули САБ на фрагменти за допомогою трипсину. Результати цього дослідження показали, що структурні домени молекули САБ мають температури переходу „спіраль–клубок” при 59,4; 68,1 і 79,1 оС.



Рис. 1.

Крива термоденатурації нативного САБ (А) і криві її деконволюції (I, II, III, IV)


Розкладення кривої теплопоглинання на складові, які апроксимуються кривими Гауса і Лоренца показує (див. рис. 1 і табл.), що основний пік теплопоглинання білка є суперпозицією двох піків з максимумами біля 66,5 і 69,7 оС. Деякі розбіжності значень температур, у порівнянні з наведеними в літературі, можуть бути повязані з неоднаковим вмістом жирних кислот в зразках альбуміну. Порівнюючи ці дані з отриманими нами значеннями температур переходів можна припустити, що в області основного максимуму кривої теплопоглинання (68 оС) відбувається плавлення двох низькотемпературних доменів САБ, а пік при 81 оС є результатом термоденатурації високотемпературного домену молекули. Розмитий і достатньо інтенсивний пік біля 97 оС потребує додаткової ідентифікації. За даними роботи [5] він може відбивати загальний процес руйнування білкової структури.

Таблиця

Вплив ТЕ на термоденатурацію САБ

Номе-ри

піків

Температура термоденатурації, оС

САБ (контроль)

САБ+ЕПЗС

САБ+ЕПС

САБ+ЕСС

Крива А

Скла-дові

Крива Б

Скла-дові

Крива В

Скла-дові

Крива Г

Скла-дові

I




66,5













48

47

II

68

69,7

73,8

80

70,5

68

74

73

III

81

80




83




71




75

IV

97

101

102

102

100

100

102

99


З отриманих термограм самих ТЕ можна бачити, що їх склад досить гетерогенний. Про це свідчать широкі і розмиті піки, які починаються в області 23-25 оС і завершуються при температурах більше 118-120 оС (рис. 2). В той же час, всі ТЕ, які було досліджено, досить характерно впливають на параметри термоденатурації САБ (рис. 3-5).

Аналіз термограм САБ у присутності ТЕ показав, що на всіх графіках зареєстровано збільшення інтенсивності і зсув у високотемпературну область на 2,5–6 оС (залежно від виду ТЕ) основного піка теплопоглинання білка (рис. 3–5). Термоденатурація в області 97 оС у присутності ЕПЗС і ЕПС також протікає на 3-5 оС вище, ніж це спостерігається для чистого альбуміну.




Рис. 2.

Криві термоденатурації ЕПЗС (1), ЕПС (2) і ЕСС (3)






Рис. 3.

Вплив ЕПЗС на криву термоденатурації САБ (Б) і криві її деконволюції


Ці результати добре узгоджуються з даними спектрофлуориметрії [9], за допомогою яких було встановлено, що ЕПЗС і ЕПС при взаємодії з сироватковим альбуміном підвищують власну флуоресценцію триптофанових залишків білка і в сукупності свідчать про загальне підвищення жорсткості молекул білка внаслідок комплексоутворення з компонентами ТЕ [3, 9]. При цьому аналіз складових кривих термоденатурації, отриманих шляхом деконволюції свідчить, що в основний пік теплопоглинання білка, який реєструється на термограмах САБ в присутності ТЕ в області 70,5–74 оС, дають внесок усі три структурних домени білка, плавлення яких стає більш кооперативним. В той же час, для індивідуальних ТЕ спостерігаються відмінності в параметрах плавлення окремих доменів, повязаний, ймовірно, з різницею в складі їх компонент. Так, серед ТЕ, що були досліджені, ЕСС найбільше відрізняються за своїм впливом на параметри термоденатурації САБ (див. табл.). Взаємодія ЕСС з САБ, істотно впливаючи на основний пік теплопоглинання білка в напрямку підвищення температури його термоденатурації, призводить і до появи піка в низькотемпературній області. Можна припустити, що ЕСС спричиняє деякий „розупорядкуючий” вплив на область першого домена альбуміну. Можливо, саме з цим повязаний менший вплив ЕСС на параметри триптофанової флуоресценції альбуміну, що було встановлено методом спектрофлуориметрії [3, 9].

Таким чином, проведене дослідження впливу ТЕ на плавлення БСА показало, що всі ТЕ ефективно впливають на конформаційний стан альбуміну, приводячи до підвищення кооперативності процесу його термоденатурації. При цьому, найбільш виражений і близький за характером вплив на отримані криві теплопоглинання альбуміну справляють ЕПЗС і ЕПС. Це дозволяє припустити, що вказані ТЕ зв'язуються з альбуміном переважно в одних і тих же центрах сорбції. Можливо, зв’язування ЕСС з альбуміном менш специфічно і зачіпає більшу кількість ділянок зв’язування. На підставі цих фактів можна при-




Рис. 4.

Вплив ЕПС на криву термоденатурації САБ (В) і криві її деконволюції






Рис. 5.

Вплив ЕСС на криву термоденатурації САБ (Г) і криві її деконволюції


пустити, що і біологічна дія ЕСС селезінки буде відрізнятись від дії екстрактів інших органів.

В цілому отримані результати свідчать, що ТЕ, які досліджувались, впливають на властивості молекули БСА і ступінь цього впливу залежить від виду тканини, з якої одержано екстракти.
Висновки:

1. Методом ДСК встановлено, що пептиди екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней зв’язуються з альбуміном і впливають на його конформаційний стан.

2. Показано, що пептиди екстрактів підвищують загальну кооперативність плавлення молекули САБ, але вплив ЕПС і ЕПЗС на молекулу САБ відрізняється від впливу ЕСС. Цей факт може мати значення при дослідженні біологічної дії таких екстрактів.
Література

1. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Под ред. Ю.А.Грызунова и Г.Е.Добрецова. Книга 2.– Москва: ГЭОТАР, 1998.– 440 с.

2. Гальченко С.Є., Бєлочкіна И.В., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Вплив екстрактів підшлункової залози і печінки свиней на щурів з експериментальними патологіями відповідних органів // Трансплантологія.–2003.–Т. 4, № 1.–С. 68-70.

3. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Зинченко А.В., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Паценкер Л.Д. Исследование механизмов взаимодействия биологически активных ксеногенных тканевых экстрактов с сывороточным альбумином // Матер. I міжнар. науково-практ. конфер. "Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок".– Тернопіль, 2004.– С. 332-335.

4. Зинченко А.В., Соловьева А.С. Влияние замораживания на термоденатурацию сывороточного альбумина быка // Проблемы криобиологии.– 1977.– № 3.– С. 61-62.

5. Казицына С.Ю., Сочава И.В. Проявление структурных переходов бычьего сывороточного альбумина в сканирующей калориметрии // Биофизика.– 1990.– Т. 35, № 2.– С. 212-215.

6. Кожевников А.Д. Роль модифицированного сывороточного альбумина в патогенезе нефропатий: некоторые факты и гипотезы // Нефрология. —1997.—Т. 1, № 3.— С. 34-38.

7. Методы практической биохимии: Пер. с англ. Д. Уильямс, К.Уилсон / Под ред. С.Е.Северина и А.Д.Виноградова.– М.: Мир, 1978.– 268 с.

8. Пат. 64381 А Україна, МПК7 А61К35/12. Спосіб отримання екстрактів ксеногенних органів; Пат. 64381 А Україна, МПК7 А61К35/12; С.Є. Гальченко, Н.Ю. Шкодовська, Б.П. Сандомирський, В.І. Грищенко; ІПКіК НАН України.– № 2003054649; Заявл. 22.05.2003; Опубл. 16.02.2004; Бюл. Промисл. власність № 2.

9. Ромоданова Э.А., Дюбко Т.С., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Погожих Д.Н. Изучение влияния НИЛИ на взаимодействие альбумина с экстрактами различных тканей // Тез. докл. XXI Междунар. научно-практич. конфер. «Применение лазеров в медицине и биологии», Одесса, 2004.– C. 110-111.

10. Спектор И.М. Влияние исходного состояния белка на направление и степень изменений под действием денатурирующего агента // Биофизика. —1996.—Т. 11, № 3.— С. 406-411.

11. Степуро И.И., Лапшина Е.А., Чайковская Н.А. Исследование тепловой денатурации сывороточного альбумина человека в водно-спиртовых и водно-солевых растворах в присутствии органических лигандов // Молекулярная биология.– 1991.– Т. 25, № 2.– С. 337-347.

12. Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л., Борисенко С.Н., Троицкий Г.В. Микрокалориметрическое исследование доменной организации сывороточного альбумина // Молекулярная биология.– 1985.– Т. 19, № 4.– С. 1072-1078.

13. Титов В.Н. Альбумин, транспорт насыщенных жирных кислот и метаболический стресс-синдром // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Ред. Ю.А.Грызунов, Г.Е.Добрецов.– М.: ГЭОТАР, 1998.– С. 58-76.

14. Aki H., Yamamoto M. Thermodynamic characterization of drug binding to human serum albumin by isothermal titration microcalorimetry // J. Pharm. Sci.– 1994.– Vol. 83(12).– P. 1712-1716.

15. Biltonen R.L., Freire E. Thermodynamic characterization of conformational states of biological macromolecules using differential scanning calorimetry // CRC Crit. Rev. Biochem.– 1978.– Vol. 5 (2).– P. 85-124.

16. Bleustein C.B., Sennett M., Kung R.T., Felsen D., Poppas D.P., Stewart R.B. Differential scanning calorimetry of albumin solders: interspecies differences and fatty acid binding effects on protein denaturation // Lasers Surg. Med.–2000.– Vol. 27(5).– P. 465-470.

17. Pico G.A. Thermodynamic features of the thermal unfolding of human serum albumin // Int. J. Biol. Macromol.– 1997.– Vol. 20(1).– P. 63-73.

18. Rosso S.B., Gonzalez M., Bagatolli L.A., Duffard R.O., Fidelio G.D.. Evidence of a strong interaction of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide with human serum albumin // Life Sci.– 1998.– Vol. 63(26).– P. 2343-2351.

С.Є. Гальченко, Т.С. Дюбко, О.В. Зінченко, Б.П. Сандомирський,

Є.А. Поврозін

Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну

В роботі за допомогою методу диференціальної скануючої калориметрії було встановлено, що пептиди екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней зв’язуються з альбуміном і впливають на його конформаційний стан. Показано, що пептиди екстрактів підвищують загальну кооперативність плавлення молекули альбуміну, але характер впливу залежить від органу, з якого вони отримані. Цей факт може мати значення при дослідженні біологічної дії таких екстрактів.

Ключові слова: калориметрія, альбумін, конформація, екстракт, пептиди.
S.E. Galchenko, T.S. Dyubko, O.V. Zinchenko, B.P. Sandomyrsky,

E.A. Povrozin

INVestigation of xenogenous tissue extracts effect on the process of albumIn thermodenaturation

Using the method of differential scanning calorimetry it was established in the work that peptides from cryopreserved pig organ fragments extracts bind to albumin and affect its conformation. It was shown that extract peptides increase the total melting cooperativity of albumin molecule, but the effect characteristics depend on organ they were derived from. This fact may be important while studying the biologically action of such extracts.

Key words: calorimetry, albumin, conformation, extract, peptides.



поділитися в соціальних мережах



Схожі:

План План 2 Вступ 3 Суть макроекономічного аналізу 4 Макроекономічні...
«рецепти», методи актив­ного впливу на об'єкт свого дослідження, тобто на процес сування у практиці господарювання. Вона також безпо­середньо...

Програма заліку з маркетингових досліджень для студентів 5 курсу...
План І процес дослідження. Послідовність етапів дослідження. Типові помилки у плануванні маркетингових досліджень

Програма іспиту з маркетингових досліджень для студентів 5 курсу...
План І процес дослідження. Послідовність етапів дослідження. Типові помилки у плануванні маркетингових досліджень

Дослідження є навчально-виховний процес у школі
Автор: Потапенко Л. М., учитель української мови І літератури Новоодеської загальноосвітньої школи І-ІІІ ступенів №2

Нестандартний урок в початковій школі
В статті визначено поняття «нестандартного уроку», дана класифікація нестандартних уроків, розкрита специфіка нестандартного уроку...

Реферат з курсу “
Значна політизованість, применшення впливу західної економічної науки або трактування цього впливу переважно з негативного боку,...

Доповідь
Щоб навчальний процес був успішним, треба розвивати пізнавальну активність школярів. А це свідомий процес здобуття знань, перетворення...

Дослідження проблеми інвестування економіки завжди знаходилось у...
Але де знайти гроші? Згідно з визначенням гроші є у інвесторів, але більшість їх знаходиться за кордоном, де фінансисти грають за...

Дослідження різноманітності рослин Черкащини на тему: “
Мета нашого дослідження зібрати І опрацювати інформацію про різноманітність рослин на Черкащині

Дослідження ринку
Дослідження фірмової структури ринку: конкуренти, посередники, постачальники



База даних захищена авторським правом © 2017
звернутися до адміністрації

l.lekciya.com.ua
Головна сторінка